中药干预干细胞移植治疗脑血管病

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2013.49.024

摘要/Abstract

摘要：

背景：干细胞在适当条件下可诱导分化为神经样细胞，中药对细胞增殖分化会有一定的影响。
目的：探讨不同中药对干细胞移植治疗脑血管病的实验研究。
方法：通过数据库检索的方式分析中药干预干细胞移植治疗脑血管病的实验研究。在体外特定的条件下，干细胞以悬浮成球或单层贴壁的方式增殖，具有可以诱导分化为神经元、少突胶质细胞和星形胶质细胞的潜能，为干细胞移植治疗脑血管病提供可能。通过检测神经细胞标志物巢蛋白、胶质纤维酸性蛋白、微管相关蛋白等表达来分析干细胞的增殖分化。
结果与结论：黄芩苷或黄芪皂甙Ⅳ等中药可以促进干细胞在体外向神经细胞分化。脑脉通或丹参等中药联合骨髓间充质干细胞移植可以促进脑血管病大鼠神经功能的修复。补阳还五汤能显著促进脑缺血后室下区神经干细胞增殖和神经功能恢复。中药在干预干细胞治疗帕金森病的多巴胺能神经元方面可以提高移植细胞的存活率，防止大部分细胞发生凋亡，如止颤汤、三七总皂甙等。益气升阳法或人参皂苷Rg1等联合干细胞治疗痴呆大鼠可以良好改善记忆能力。干细胞经过中药诱导干预后会对脑血管病起到促进治疗的作用。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

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关键词: 干细胞, 干细胞学术探讨, 中药, 脑血管病, 脑卒中, 胚胎干细胞, 骨髓间充质干细胞, 骨髓单个核细胞, 分化, 神经细胞

Abstract:

BACKGROUND: Stem cells under appropriate conditions can be induced to differentiate into neuron-like cells. Chinese herbs can function in cell proliferation and differentiation.
OBJECTIVE: To investigate the interventional effects of traditional Chinese medicine on stem cell transplantation in the treatment of cerebrovascular diseases.
METHODS: Experimental studies concerning traditional Chinese medicine intervention for stem cell transplantation were retrieved and analyzed. Under specific conditions, stem cells can proliferate in vitro in a suspended or monolayer manner, and can be potentially induced to differentiate into neurons, oligodendrocytes and astrocytes, thereby providing basis for stem cell transplantation in the treatment of cerebrovascular diseases. We observed expressions of nestin, glial fibrillary acidic protein, and microtubule-associated protein expression for analysis of stem cell proliferation and differentiation.
RESULTS AND CONCLUSION: Baicalin or Astragalus saponin Ⅳ can stimulate stem cells to differentiate into nerve cells in vitro. Naomaitong or danshen combined with bone marrow mesenchymal stem cell transplantation can promote neurological recovery from cerebrovascular diseases in rats. Buyang Huanwu Decoction can significantly promote the proliferation of neural stem cells in the subventricular zone and neurological recovery after cerebral ischemia. Chinese herbs, such as Zhichan Decoction and Panax notoginseng, can promote survival of transplanted cells and prevent most cell apoptosis in the stem cell therapy for treatment of Parkinson’s disease. Therapy of benefiting qi and elevating yang or ginsenosides Rg1 combined with stem cell therapy can improve memory ability of dementia rats. Traditional Chinese medicine exerts a catalytic role in the stem cell therapy for cerebrovascular diseases.

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Key words: stem cells, mesenchymal stem cells, neural stem cells, drugs, Chinese herbal, cerebrovascular disorders

中图分类号:

R318

王妍，熊杰. 中药干预干细胞移植治疗脑血管病[J]. 中国组织工程研究, 2013, 17(49): 8615-8620.

Wang Yan, Xiong Jie. Traditional Chinese medicine intervention for stem cell transplantation in the treatment of cerebrovascular diseases [J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2013, 17(49): 8615-8620.

图/表（结果） 3

2.1 中药干预干细胞向神经细胞诱导分化 在体外特定的条件下，神经干细胞以悬浮成球或单层贴壁两种方式增殖，具有可以诱导分化为神经元、少突胶质细胞和星形胶质细胞的潜能，为干细胞移植治疗脑血管病提供可能。神经干细胞的标志物包括巢蛋白、微管相关蛋白、胶质纤维酸性蛋白、p75神经营养R等。巢蛋白是中间纤维家族的成员，被列为第Ⅵ类中间纤维，其结构和分子量与其他的中间纤维成员有差异。巢蛋白基因的第二个内含子上有两个增强子，即中脑特异性增强子和中枢神经系统增强子。微管相关蛋白，神经元特殊形态的形成以及维持主要依赖于神经元细胞骨架中微管的装配，在此过程中，涉及到微管组成和动力学性质，最终形成稳定的微管结构，在神经元中，这一结构为沿着神经突运输物质提供了基础。胶质纤维酸性蛋白是脑内星形胶质细胞中间纤维的结构蛋白组成成分，最早从脑内星形胶质细胞中分离出来，并逐渐被人们看做成熟和反应性星形胶质细胞的特征性标记物，是全脑所有星形胶质细胞的特异性免疫组化标记物。

2.1.1 中药干预神经干细胞向神经细胞诱导分化 神经干细胞是一群能够自我更新并具有多种分化潜能的细胞，来源于神经组织并可生成神经组织，在适当条件下可分化成神经元、少突胶质细胞和星形胶质细胞。实验研究表明成年哺乳动物神经干细胞内仍然存在神经发生。目前，已明确的部位有海马齿状回、室管膜下区等^[4-8]。神经干细胞移植物在宿主中枢神经系统内具有明显的生存、迁移和分化能力，由人胎脑分离的神经干细胞在植入胚胎或新生鼠脑内后，表现为在宿主脑内迁移并进行区域特异性分化，若将相同的人胎脑神经干细胞植入成年大鼠室管膜下区，神经干细胞沿吻侧迁移流迁移入嗅球，分化为双极神经元，其分化命运与存留于室管膜下区的内源性神经干细胞相同。从成年哺乳动物中枢神经系统分离的神经干细胞也具有较强的分化潜能，而决定神经干细胞分化命运的主要因素除局部微环境外，还包括神经干细胞的内在特性。

解俊领等^[9]研究早期胚胎神经干细胞定向诱导分化为神经元，将细胞放在含有2%B27的DMEM/F12培养液中，经维甲酸在37 ℃、体积分数为5%的CO₂常规培养条件下诱导分化5 d，通过免疫组织化学技术检测显示表达神经干细胞或前体细胞特异性标志蛋白巢蛋白以及神经元特异性标志蛋白β Ⅲ微管蛋白。崔猛等^[10]观察黄芩苷促进神经干细胞体外向神经元分化，从孕十四五天的SD大鼠胚胎大脑皮质中分离神经干细胞，体外培养传代，选用第3代神经干细胞，培养6 d后细胞免疫荧光化学染色法观察微管相关蛋白2、胶质纤维酸性蛋白表达水平，培养2 h和6 d后检测转录激活子蛋白磷酸化水平，其结果见表1。

同时，黄芩苷还可以下调神经干细胞中转录激活子3蛋白磷酸化水平，白血病抑制因子+碱性成纤维细胞生长因子可以上调神经干细胞中转录激活子3蛋白磷酸化水平，黄芩苷可以抑制白血病抑制因子+碱性成纤维细胞生长因子引起的神经干细胞中转录激活子3蛋白磷酸化水平的上调。可见，黄芩苷可以诱导神经干细胞向神经元分化，并抑制其向星形胶质细胞分化。

2.1.2 中药干预骨髓间充质干细胞移植向神经细胞诱导分化 张全伟等^[11]研究红景天苷诱导大鼠骨髓间充质干细胞向神经元样细胞分化，选取第2代Wistar大鼠骨髓间充质干细胞，按照不同诱导剂分为维甲酸诱导组、红景天苷诱导组和对照组，通过不同时间点对细胞进行观察，发现诱导组细胞不同时间点神经干细胞标志物巢蛋白和神经细胞分化相关的兔抗微管蛋白和神经微管相关蛋白2表达阳性率均高于对照组，神经胶质纤维酸性蛋白阳性率维甲酸组显著高于红景天苷组。两组细胞均有神经细胞相关基因神经元特异性烯醇化酶、神经微管相关蛋白2 mRNA表达，与诱导时间有关，且不完全相同，两组间神经胶质纤维酸性蛋白mRNA的高峰度出现在诱导的早期，诱导后神经元特异性烯醇化酶蛋白的表达随时间延长显著增加，兔抗微管蛋白表达出现于诱导早期，说明红景天苷促进骨髓间充质干细胞向神经细胞分化，其诱导效应与维甲酸相似，且向神经元样细胞定向分化方面优于维甲酸。

王莹等^[12]观察黄芪皂甙Ⅳ联合骨髓间充质干细胞移植对缺血再灌注大鼠海马神经细胞凋亡及Bcl-2、Bax、Caspase-3表达的影响，将实验动物随机分为假手术组、模型组、骨髓间充质干细胞组、骨髓间充质干细胞+黄芪组。采用线栓法建立大鼠大脑中动脉缺血模型，骨髓间充质干细胞组、骨髓间充质干细胞+黄芪组分别于建模成功后3 h经尾静脉注射已制备好的PKH26标记骨髓间充质干细胞悬液。另外，骨髓间充质干细胞+黄芪组于缺血前5 min、缺血后12，24 h腹腔注射黄芪皂甙Ⅳ。缺血再灌注72 h后检测各指标，结果见表2。

PKH26标记的骨髓间充质干细胞在海马有表达。与模型组比较，骨髓间充质干细胞组与骨髓间充质干细胞+黄芪组均能够使大鼠神经功能损害评分降低 (P < 0.01)，骨髓间充质干细胞+黄芪组神经功能恢复最为明显(P < 0.05)。模型组Bcl-2、Caspase-3、Bax蛋白表达以及细胞凋亡与假手术组差异有显著性意义(P < 0.01)。与模型组比较，骨髓间充质干细胞+黄芪组和骨髓间充质干细胞组均可下调Caspase-3、Bax蛋白表达和细胞凋亡指数(P < 0.05)，上调Bcl-2蛋白表达及Bcl-2/Bax比值(P < 0.05)，其中以骨髓间充质干细胞+黄芪组作用更为显著(P < 0.05)。实时荧光定量聚合酶链反应显示，与模型组和骨髓间充质干细胞组比较，骨髓间充质干细胞+黄芪组能显著下调Caspase-3、Bax mRNA相对表达(P < 0.05)，上调Bcl-2 mRNA相对表达，差异有显著性意义(P < 0.05)。黄芪皂甙Ⅳ联合骨髓间充质干细胞移植对脑缺血再灌注神经元细胞凋亡有协同抑制作用，其作用机制可能与黄芪皂甙Ⅳ促进骨髓间充质干细胞抑制Box、caspase-3表达，增强Bcl-2表达和Bcl-2/Bax比值有关。

2.2 中药干预干细胞治疗脑血管病 脑为髓之海。诸髓者，皆属于脑。脑髓是由人体中最精微的物质“精”所组成，先天之精是脑髓得以生成的最根本的物质基础，肾精、水谷精微、气血津液是人之脑髓赖以继续生长发育、保持充满的物质基础，也是脑产生各种功能的物质基础^[13]。中医范畴内的脑髓包括神经细胞、神经干细胞等，因此，从理论上讲有利于脑髓生成和生长的中药对神经细胞、神经干细胞的增殖分化是有利的，对神经干细胞治疗缺血性脑血管病会起到重要作用。

2.2.1 中药干预干细胞治疗脑缺血的实验研究 脑脉通联合骨髓间充质干细胞移植治疗脑缺血再灌注损伤后神经元突触重建：刘敬霞等^[14]在体外全骨髓贴壁筛选培养法扩增骨髓间充质干细胞；线栓法制备脑缺血模型；大鼠脑缺血再灌注后24 h颈内动脉移植骨髓间充质干细胞。脑脉通由大黄、人参、川芎、葛根组成，具有益气活血、解毒降浊作用，可增强骨髓间充质干细胞移植后的脑保护作用，脑脉通灌胃给药。检测各组大鼠神经功能评分以及神经丝蛋白200、神经生长相关蛋白43和突触素表达的比较，见表3。

在表3可显示，与假手术组比较，各组神经功能评分均降低；脑脉通治疗组和脑脉通+骨髓间充质干细胞治疗组各时间点神经评分较模型组增高；脑脉通+骨髓间充质干细胞治疗组7，28 d组评分较骨髓间充质干细胞治疗组增高。模型各组神经丝蛋白200、神经生长相关蛋白43和突触素表达均较假手术组减弱；与模型组比较，脑脉通治疗组和骨髓间充质干细胞移植组28 d、脑脉通+骨髓间充质干细胞治疗组14，28 d大鼠神经丝蛋白200、神经生长相关蛋白43和突触素表达均明显增强；与骨髓间充质干细胞移植组比较，脑脉通+骨髓间充质干细胞治疗组14，28 d组的神经丝蛋白200和神经生长相关蛋白43表达均增强，28 d组突触素表达增强显著。脑缺血引起的神经元结构损伤随再灌注时间延长呈加重趋势，并使突触重塑功能减弱；骨髓间充质干细胞移植脑早期对神经功能修复作用不明显，脑脉通可使骨髓间充质干细胞移植后修复神经功能的作用提前并增强，其作用途径可能与增强突触重建相关生长蛋白水平，进而促进神经元突触重建相关。

此外，俞天虹等^[15]研究不同黄芪剂量的补阳还五汤对大鼠脑缺血后室下区神经干细胞增殖的影响，缺血24 h后分别给予黄芪剂量为120，60，30，15 g的补阳还五汤，腹腔注射5-溴脱氧尿嘧啶核苷50 mg•kg^-¹，1次/d，连续14 d。在缺血后第7，14天，与模型组比较，黄芪剂量为120，60 g组的补阳还五汤显著改善神经症状评分，减少大鼠右转次数；在缺血后第14天，黄芪剂量为120，60 g组的补阳还五汤显著促进室下区神经干细胞增殖(P < 0.01)。大剂量黄芪组方的补阳还五汤能显著促进脑缺血后室下区神经干细胞增殖和神经功能恢复，以黄芪剂量为120 g的效果最佳。张德凤等^[16]研究丹参联合骨髓间充质干细胞移植治疗新生儿缺氧缺血性脑损伤的可行性，研究发现植入骨髓间充质干细胞主要分布于缺氧缺血性脑损伤组左侧大脑皮质区，骨髓间充质干细胞移植+丹参组标本中骨髓间充质干细胞更多向右侧大脑半球迁移，且分布范围更广，与骨髓间充质干细胞移植组比较，不同脑组织层面、两侧大脑半球骨髓间充质干细胞计数差异具有显著性意义(P < 0.05)；免疫荧光双标记法观察骨髓间充质干细胞移植+丹参组在左侧大脑皮质、海马等部位分化为神经细胞，均可表达巢蛋白、神经元特异性烯醇化酶、胶质纤维酸性蛋白，且比骨髓间充质干细胞移植组的巢蛋白、神经元特异性烯醇化酶分化率更高，可见，加用丹参后可促进植入骨髓间充质干细胞表达巢蛋白和神经元特异性烯醇化酶。

2.2.2 中药干预干细胞治疗帕金森病的实验研究 帕金森病是一种常见的神经系统变性疾病，多见于老年人，主要病理改变是中脑黑质多巴胺能神经元的变性死亡，引起纹状体多巴胺含量显著减少，帕金森病常表现为一侧肢体震颤或活动笨拙，可以导致运动功能障碍等并发症^[17]。但是，多巴胺能神经元移植治疗帕金森病仍面临细胞存活率低的问题，大部分细胞会发生凋亡，如何提高移植细胞的存活率是多巴胺能神经元移植治疗帕金森病的关键^[18-19]。

施慧芬等^[20]从多巴胺代谢途径角度观察止颤汤对神经干细胞移植帕金森病大鼠的脑黑质中多巴胺及其代谢产物含量的变化。以大鼠脑立体定位和1-甲基-4-苯基-1，2，3，6-四氢吡啶建立帕金森病大鼠模型，应用高效液相色谱法测定帕金森病大鼠中脑多巴胺及其代谢产物的含量。研究发现止颤汤可以提高神经干细胞移植后帕金森病大鼠中脑多巴胺及其代谢产物双羟苯乙酸的含量，但对代谢产物高香草酸无明显影响。通过促进帕金森病大鼠干细胞移植后神经干细胞的存活，使之定向分化为多巴胺能神经元并分泌多巴胺，同时抑制多巴胺分解达到治疗作用。柯春龙等^[21]研究三七总皂甙对神经干细胞体外诱导分化多巴胺能神经元移植帕金森病大鼠后移植细胞的存活及移植疗效的影响。将大鼠胚胎中脑神经干细胞经传代扩增后，在分化液中诱导向多巴胺能神经元分化，应用6-羟基多巴胺制备的帕金森病大鼠模型随机分为多巴胺能神经元组、多巴胺能神经元+三七总皂甙组、三七总皂甙组及手术对照组，每组8只，移植后检测帕金森病大鼠不对称旋转行为的变化以及纹状体移植区酪氨酸羟化酶染色阳性细胞存活的情况。与手术对照组比较，移植后20 d多巴胺能神经元组大鼠不对称旋转圈数开始明显下降(P < 0.01)。移植后10-60 d，多巴胺能神经元+三七总皂甙组大鼠的不对称旋转圈数明显低于多巴胺能神经元组(P < 0.01)。免疫组织化学染色显示多巴胺能神经元+三七总皂甙组大鼠纹状体移植区酪氨酸羟化酶染色阳性细胞数明显多于多巴胺能神经元组(P < 0.01)。可见，三七总皂甙具有提高神经干细胞诱导分化的多巴胺能神经元移植帕金森病大鼠后移植细胞的存活率及移植疗效的作用。

2.2.3 中药干预干细胞治疗痴呆的实验研究 杨辉等^[22]研究益气升阳法对骨髓间充质干细胞移植治疗血管性痴呆大鼠学习记忆的影响。选用益气升阳法代表方，益气聪明汤为基础加减，组成经验方脑通胶囊来益气健脾，升阳益髓。建立大鼠血管性痴呆模型，造模7 d后移植组及中药组注射骨髓间充质干细胞悬液于海马；中药组动物给予中药灌胃，其余组灌胃生理盐水，连续25 d后进行水迷宫训练5 d，第5天用水迷宫检测各组大鼠的学习记忆功能。研究发现模型组与正常组相比，逃避潜伏期明显延长，差异具有显著性意义(P < 0.05)；中药组与模型组相比，逃避潜伏期明显缩短(P < 0.05)；中药组与移植组比较，差异有显著性意义(P < 0.05)。骨髓间充质干细胞移植联合中药治疗血管性痴呆大鼠有良好的改善记忆作用。邬伟等^[23]研究发现人参皂苷Rg1能够加强骨髓间充质干细胞移植治疗痴呆模型大鼠的学习记忆能力，其机制可能与人参皂苷Rg1上调骨髓间充质干细胞植入痴呆大鼠基底前脑神经元神经生长因子的表达有关。

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引言

材料方法

讨论

干细胞移植治疗脑血管病的研究是目前神经科学的研究热点，成年哺乳动物神经细胞无法通过内源性作用使缺失的细胞恢复，在特定的条件下，干细胞可以诱导分化为神经元、少突胶质细胞和星形胶质细胞，为干细胞移植治疗脑血管病提供可能，对脑血管病引起的神经细胞死亡中起到修复作用。在中医理论上，有利于脑髓生成和生长的中药对干细胞、神经细胞的增殖分化是有利的，可以通过干预植入的干细胞起到抑制细胞凋亡、提高移植细胞存活率、改善局部血液循环等作用，但作用机制还需要进一步研究。例如，黄芩苷或黄芪皂甙Ⅳ等中药可以促进干细胞在体外向神经细胞分化。脑脉通可使骨髓间充质干细胞移植后修复神经功能的作用提前并增强，促进神经元突触重建。丹参可以促进骨髓间充质干细胞治疗新生儿缺氧缺血性脑损伤表达巢蛋白和神经元特异性烯醇化酶。黄芪剂量为120 g的补阳还五汤能显著促进脑缺血后室下区神经干细胞增殖和神经功能恢复。中药在干预干细胞治疗帕金森病的多巴胺能神经元方面可以提高移植细胞的存活率，防止大部分细胞发生凋亡，如止颤汤、三七总皂甙等。益气升阳法或人参皂苷Rg1等联合干细胞治疗痴呆大鼠可以良好改善记忆能力。可见，干细胞经过中药诱导干预后会对脑血管病起到促进治疗的作用。随着科学技术的进步，干细胞的基础研究与临床应用会进一步提高，相信会使脑血管病的治疗得到根本的改变。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程
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